Ａｐｒ．２０１７．３７（２） 实验动物与比较医学ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８９ ｄｏｉ：１０．３９６９０．ｉｓｓｎ．１６７４・５８１７．２０１７．０２．００２ Ａｆｐ－ｃｒｅ．１ａｃＺ转基因小鼠的构建 顾晓雯・，孙瑞林ｚ，费俭１ （１．同济大学生命科学与技术学院，上海２０００９２； ２．上海南方模式生物科技股份有限公司，上海２０１２０３） ［摘要】目的研究甲胎蛋白（Ａｆｐ）ｌ￣Ｅｌ性细胞的增殖分化在组织生长修复，肿瘤发生过程中的作用， 建立Ａｅｐ．ＣｒｅＥＲＴ转基因小鼠细胞示踪系统。方法 采用ＤＮＡ雄原核显微注射方法获得Ａｆｐ— ＣｒｅＥＲＴ转基因小鼠，筛选出合适的品系后，使之与Ｒｏｓａ２６一ｌａｃＺ工具小鼠杂交，获得Ｃｒｅ￣ａｃＺ双 阳性的Ａｆｐ—ｃｒｅ—ｌａｃＺ转基因小鼠。结果 显微注射后，共出生小鼠５６只，经ＰＣＲ鉴定Ｃｒｅ阳性 小鼠共４只，阳性小鼠传代后各为一系。筛选内源性Ａｌｐ表达与Ｃｒｅ表达相对符合的品系作为Ａｆｐ． ＣｒｅＥＲＴ转基因小鼠品系建系。Ａｆｏ．ＣｒｅＥＲＴ转基因小鼠与Ｒｏｓａ２６一ｌａｃＺ工具小鼠杂交，经ＰＣＲ鉴定 后获得ＣｒｅｆｌａｃＺ双阳性的Ａｆｐ—ｃｒｅ—ｌａｃＺ转基因小鼠。经实时ＰＣＲ，Ｘ—ｇａｌ染色，免疫荧光染色鉴定 后得到Ａｆｐ—ｃｒｅ—ｌａｃＺ转基因小鼠细胞示踪系统，同时证实该系统能够正确示踪Ａｆｐ表达阳性的细 胞，同时也能够应用于肝损伤小鼠模型中。结论成功构建了Ａｆｐ．ｃｒｅ．１ａｃＺ转基因小鼠细胞示踪 系统，为研究这类细胞的谱系发生提供了工具。 ［关键词】甲胎蛋白（Ａｆｐ）；转基因小鼠模型；细胞示踪 ［中图分类号】Ｑ９５．３３［文献标识码］Ａ［文章编号】１６７４—５８１７（２０１７）０２—００８９—０５ 甲胎蛋（￣（ａｌｐｈａ—ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ａｆｐ）是由ａｆｐ基因 对Ａｆｐ表达阳性的细胞类群的研究并不多见。在正 常的成体组织器官中，是否还有ＡｆＤ阳性细胞？如 果有，那么这些细胞与胚胎期的Ａｆｐ阳性细胞有何 关联？在组织发育、损伤修复甚至是肿瘤形成的过 编码的一种糖蛋白，属于血清白蛋白一类的蛋白家 族。该蛋白于１９５６年自人类胚胎中首次被发现…。 在胚胎发育过程中，Ａｆｐ基因开放表达，并且合成 具有重要功能的Ａｆｐ［２１。但随着发育完成，Ａｆｐ的 表达量逐渐降低，出生２年后，血清中基本已经 检测不到Ａｆｐ［３，４１。成年以后的Ａｆｐ的高表达往往与 程究竟扮演怎样的角色？这些问题目前还不明了。 为了研究表达ＡｆＤ表达阳性的这类细胞的功能，本 文利用ＣｒｅＥＲＴ—ｌｏｘＰ系统建立了以Ａｆｐ基因表达为 肿瘤密切相关【 。在对肝脏肿瘤的临床诊断中，血 清中Ａｆｐ的含量甚至成为了一项重要指标【６’７］。在生 物学方面，有研究［８］指出Ａｆｐ基因的表达与肝癌细 胞的增殖相关，是一种促癌基因。还有研究［ ］显 标志的小鼠细胞谱系活体模型，并在肝脏中，验 证了这一模型的应用。 １材料与方法 １．１材料 示，在一些肝癌细胞中，Ａｆｐ基因的表达甚至与表 观调控有关。由此可见，Ａｆｐ与细胞的发育、增 １．１．１实验动物ＳＰＦ级雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊｄ￣鼠，８—１２周 殖密切相关，针对其作用与机制的研究多有报道。 然而从细胞角度来说，以Ａｆｐ为细胞表面标记，针 ［收稿日期】２０１７—０２．０５ 龄，上海南方模式生物科技股份有限公司提供 ［ＳＣＸＫ（沪）２０１４．０００２】，所有动物实验均在上海南 方模式生物研究中心完成［ＳＹＸＫ（沪）２０１３—００３５］。 动物实验方案获得公司动物伦理委员会的批准。 １．２试剂和实验仪器 ＰＣＲ试剂盒Ｔａｑ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ、反转录试 剂盒ＦａｓｔＱｕａｎｔ ＲＴ Ｓｕｐｅｒ Ｍｉｘ、Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ试剂 ［基金项目】国家重点基础研究发展计划（２０１０ＣＢ９４５５０１） 【作者简介】顾晓雯（１９８８一），女，博士，从事生物化学与分子生 物学研究。Ｅ—ｍａｉｌ：１７ｇｕｘｉａｏｗｅｎ＠ｔｏｎ鲥ｉ．ｅｄｕ．ｃａ 【通讯作者］费俭，教授。Ｅ—ｍａｉｌ：ｊｆｅｉ＠ｔ０ｎ舀ｉ．ｅｄｕ．ｃａ 实验动物与比较医学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 盒ＳｕｐｅｒＲｅａｌ ＰｒｅＭｉｘ Ｐｌｕｓ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、ＴＲｉＺｏｌ购 自北京Ｔｉａｎｇｅｎ公司，ＧｅｎｅｎＲｕｌｅｒｌ ｋｂ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ 购自美国ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，他莫昔芬、玉米 油、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ染料、硫酸铝钾十二水合 物、六氰基亚铁酸钾三水合物、铁氰化钾、氯化 镁六水合物、Ｎ，Ｎ一二甲基甲酰胺、ＩＧＥＰＡＬ、戊 二醛、多聚甲醛购白美国Ｓｉｇｍａ公司，ａｎｔｉ—ｌａｃＺ、 ａｎｔｉ—ＡＦＰ一抗、山羊抗鸡（ｇｏａｔ Ａｎｔｉ—Ｃｈｉｃｋｅｎ）ＩｇＹ Ｈ＆Ｌ（Ｃｙ３）购白美国Ａｂｃａｍ公司，山羊抗兔（ｇｏａｔ ａｎｔｉ．ｒａｂｂｉｔ）（ＦＩＴＣ）二抗购自上海碧云天公司、其他 常规化学试剂购白中国国药集团化学试剂有限公 司。ＰＣＲ仪和Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ仪购白德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 公司，光学显微镜９０ｉ购自日本Ｎｉｋｏｎ公司，共聚 焦显微镜Ｆｖｌ０ｉ购自日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司，冰冻切片 机购自美国Ｔｈｅｒｍｏ公司。 １．３实验方法 １．３．１基因组鉴定小鼠基因组提取：小鼠出生后２周 内，剪取长约０．３ ｃｍ左右的鼠尾。加入４００ Ｌ裂 解液（包含质量分数１０％ＳＤＳ、１ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、 ０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ１以及４０ ｕＬ蛋白酶Ｋ （１０ ｍｇ／ｍＬ））。置于５６℃杂交炉内，消化过夜。离 心取上清，加入８００ Ｌ无水乙醇沉淀，沉淀用体 积分数７５％乙醇洗涤１次，稍晾干后溶解于１００ ｇＬ ｄｄＨ ０中，４℃溶解过夜。获得小鼠基因组ＤＮＡ。 ＰＣＲ鉴定：利用ＰＣＲ试剂盒Ｔａｑ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ 扩增鉴定片段，反应体系参见说明书。反应条件为： ９４℃预变性３ ｍｉｎ；９４℃变性２０ Ｓ，５８℃退火３０ Ｓ， ７２℃延长３０ Ｓ，变性至延长步骤共３５个循环，７２℃ 延长１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ产物质量分数ｌ％琼脂糖凝胶电 泳鉴定。 引物序列： Ａｆｐ—ｃｒｅ正向引物：５＇－ＴＣＴＧＣＴＡＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＡ—ＴＧＧＣ一３’ Ａｆｐ—ｃｒｅ．反向引物：５＇－ＴＴＧｃＡｃＧＴＴｃＡｃＣＧＧＣＡＴＣ一３’ １．３．２ 实时定量ＰＣＲ检测 小鼠颈椎脱臼处死之后 取心、肝、脾、肺、肾和骨髓组织提取ＲＮ Ａ。 使用反转录试剂盒ＦａｓｔＱｕａｎｔ ＲＴ Ｓｕｐｅｒ Ｍｉｘ翻转成 ｃＤＮＡ模板。使用Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ试剂盒ＳｕｐｅｒＲｅａｌ ＰｒｅＭｉｘ Ｐｌｕｓ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ检测ＲＮＡ表达情况。 引物序列： Ｃｒｅ一正向引物：５＇－ＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＧＧＴＡＴＴＧＡＡ．３’ Ｃｒｅ一反向引物：５＇－ＡＧＣＧＡＴＧＧＡＴＴＴＣＣＧＴＣＴＣＴＧＧ．３’ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ—Ａｆｐ一正向引物：５＇－ＣＴＴＣＣＣＴＣＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣ— ＴＡＣ一３’ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ—Ａｆｐ一反向引物：５’一ＡＣＡＡＡＣＴＧＧＧＴＡＡＡＧＧＴＧＡ— ＴＧＧ一３’ ［３－ａｃｔｉｎ一正向引物：５＇－ＧＧＣＴＧＴＡＴＴＣＣＣ ＣＴＣＣＡＴＣＧ一３’ Ｂ—ａｃｔｉｎ一反向引物：５＇－ｃｃＡＧＴＴＧＧＴＡＡｃＡＡＴＧｃｃＡＴＧＴ一３’ １．３．３他莫昔芬诱导表达配制２０ ｍｇ／ｍＬ他莫昔 芬／玉米油溶液；按小鼠体质量１２０ ｍｇ／ｋｇ剂量， 隔日、腹腔注射给药，共给药５次，给药２周后 进行后续实验。 １．３．４ 组织标本处理以及冰冻切片取小鼠肝脏组 织，质量分数４％多聚甲醛４℃固定４ ｈ，换质量 分数１５％蔗糖脱水过夜，换质量分数３０％蔗糖脱 水８ ｈ，冰冻切片包埋￣ｍＪ（ＯＣＴ）包埋组织后切片。 切片厚度１ ０ ｇｍ。 １．３．５ Ｘ—ｇａｌ染色取冰冻切片，置于冰上，２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣ１２／ＰＢＳ洗２次，每次５ ｍｉｎ，去除ＯＣＴ。配 置洗涤溶液（含质量分数０．０２％ＮＰ一４０以及２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２）洗涤切片，后将切片置于Ｘ—ｇａｌ染液，３７℃ 染色过夜。次日，复染核快红，常规梯度脱水， 透明后树脂封片，光学显微镜下观察。 １．３．６免疫荧光染色冰冻切片３７℃复温３０ ｍｉｎ 后，６０℃烘箱烘干：体积分数０．５％Ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳ洗 ２～３次，免疫组织化学封闭液封闭１ ｈ，一抗４℃ 孵育过夜，ＰＢＳ洗３次，加入二抗以及ＤＡＰＩ常温 孵育１ ｈ，ＰＢＳ洗３次后封片，置于激光共聚焦显 微镜下观察。 １．３．７ 肝损伤模型 参考２一乙酰氨基芴（２．Ａｃｅｔｙ． １ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｎｅ，２－ＡＡＦ）给药辅以肝部分切除（Ｐａｒｔｉａｌ Ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ，ＰＨ）手术联用的方法【ｌ０，“］，作者制作 了小鼠肝损伤模型。具体实验方案为，１０ ｍｇ／ｋｇ ２一ＡＡＦ灌胃给药，连续给药４ ｄ；第５日进行肝切除 手术；第６日，第８曰以１２０ ｍｇ／ｋｇ的剂量，灌胃给他 莫昔芬，共２次；同时，手术后继续以１０ ｍｇ／ｋｇ ２．ＡＡＦ的剂量灌胃给药，每日一次，７ ｄ后取小鼠 肝脏组织，进行检测。 ２结果 ２．１ Ａｆｐ ＣｒｅＥＲＴ转基因小鼠获得 转基因小鼠制备方式为小鼠受精卵细胞原核 ＤＮＡ显微注射。ＡＦＰ质粒ＤＮＡ（上海南方模式生物 科技股份有限公司提供）用ＳａｃＩＩ酶切，凝胶回收酶 切大片段（约２４ ｋｂ）后进行小鼠受精卵细胞原核ＤＮＡ 显微注射（图１Ａ、Ｂ）。显微注射出生５６只小鼠于 Ａｐｒ．２０１７．３７（２） 实验动物 ｊ比较 学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９ｌ ２剧龄剪尾，抽提基冈组ＤＮＡ，经ＰＣＲ，筛选发 现４ 转基 阳性小鼠（图ｌＣ）。 性小鼠和数 野 生 小鼠｝Ｉ 次剪尾抽提基冈组ＤＮＡ，双卣再次进 行ＰＣＲ检测，确认４ 为转基冈阳性小鼠，并作 中２系小鼠的Ｃｒｅ的ＲＮＡ表达为阴性，故 以淘 汰。 外２系小鼠中选择表达情况与内源Ａｆｐ基冈 （ｅ—Ａｆｐ）表达谱史为接近的ｌ系小鼠继续繁碴，作为 Ａｆｐ ＣｒｅＥＲＴ转基冈小鼠进行保留，另ｌ系小鼠则 淘汰（图ｌＤ）。 为首建者小鼠，其后代单独建系， 获得４个品 系的待筛选Ａｆｐ—ＣｒｅＥＲＴ转基冈小鼠。 ２．３ Ａｆｐ．ｃｒｅ．１ａｃＺ转基因小鼠Ｘ．ｇａｌ染色鉴定 ２．２ Ａｆｐ．ＣｒｅＥＲＴ转基因小鼠Ｃｒｅ表达情况检测 将４ ｌ首建者小鼠与野生 小鼠进行传代建 系，取后代小鼠，检测其Ｃｒｅ表达情况，表明其 将ＡｆＤ—ｃｒｅＥＲＴ转基冈小鼠与Ｒｏｓａ２６一ｌａｃＺ Ｉ 只 小鼠杂交，获得Ｃｒｅ／ｌａｃＺ双阳性的Ａｆｐ—Ｃｒｅ．１ａｃＺ品 系的细胞示踪小鼠。取１月龄Ａｆｐ—ｃｒｅ—ｌａｃＺ品系小 （Ｃ） ２０００ｂｐ １５００ｂｐ ｌＯ０ｏｂ （Ｂ） ＳａｃＩｌ＋ Ｓａｅｌｌ－ ＃《葫 ｛ 漆 黔 Ｍ （Ｄ） ２００００ｂｐ １００００ｂｐ ７０００ｂｐ Ａ：小鼠受精卵 胞 核ＤＮＡ 微沣叼ｌＪ用质粒，Ｊ÷意 ；Ｂ：ＤＮＡ 微沣射用质粒，Ｓａｃｌｌ酶切后的质粒ｌ也泳 ，ＳａｃＩＩ＋衷，Ｊ÷嗨 后产物，ＳａｃｌＩ表／ｊ÷阴忡对照，Ｍ表，Ｊ÷ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；Ｃ： 微沣 后…生的小鼠Ａｆｐ—ＣｒｅＥＲＴ 编 ，（一）表，＇÷阴一 对照，０表 ÷ ［ｊ泳道，（＋）表，Ｊ 型 定，ｌ一４衷 ÷小鼠 【大】以 斗对照，Ｍ表／Ｊ÷ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；Ｄ：Ａｌｐ—ＣｒｅＥＲＴ转 Ｉ 小鼠内源 及Ｃｒｅ綦 ｌ： 组织中的表达情 ，ｅ—ＡＦＰ农 内源性ＡＪｐ ｌ大】 图１ Ａｆｐ．ＣｒｅＥＲＴ转基因小鼠品系鉴定 Ａ：ｐｌａｓｍｉｄ ｄｉａｇｒａｍ；Ｂ：ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，ＳａｃｌＩ＋：ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，ＳａｃＩＩ一：ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｍ：ｍａｒｋｅｒ；Ｃ：ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｉｄｅｎｔｉｉｃａｔｆｉｏｎ ｏｆ Ａｆｐ—ＣｒｅＥＲＴ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ，（）：ｎｅｇ￣ｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ，０：ｂｌａｎｋ，（＋）：ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｍ：ｍａｒｋｅｒ；Ｄ：Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅ—Ａｆｐ ｏｒ Ｃｒｅ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｓ，ｅ－ａｆｐ：ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ 加 Ｆｉｇｕｒｅ ｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｆｐ－ＣｒｅＥＲＴ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ 左 图２ Ａｌｐ．ｃｒｅ．１ａｃＺ转基因小鼠肝脏组织Ｘ—ｇａｌ染色结果 ｌｅｆｔ：ｔａｍｏｘｉｆｅｎ ｎｅｇａｔｉｖｅ（Ｔａｍｏ一）：ｒｉｇｈｔ：ｔａｍｏｘｉｆｅｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｒｏｕｐ（Ｔａｍｏ十）；Ａｒｒｏｗｓ ｐｏｉｎｔ ｔｏ Ｘ—ｇａｌ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ；ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ（２００×） Ｆｉｇｕｒｅ ２ Ｘ－ｇａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ａｆｐ－ｃｒｅ－ｌａｅＺ ｍｉｃｅ ｌｉｖｅｒ ９２ 史验动物 。比较 学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 鼠，给 他荧昔芬诱导之后取其肝脏组织，进行 Ｘ—ｇａｌ染 鉴定。经过他荚昔芬 导后，Ｘ—ｇａｌ染 定化的检测。榆测 示，Ａｆｐ ｊ １ａｃＺ能够 小鼠，Ｊ 定化（图３）。冈此，Ａｆｐ—ｅｒｅ—ｌａｃＺ转 色ｌ５日性细胞 现在肝脏内（图２）。 ２．４ Ａｆｐ．ｃＦｅ．１ａｃＺ转基因小鼠免疫荧光染色鉴定 为了检验肝脏ｘ—ｇａｌ染色 性ｎ勺细胞是 为 Ａｆｐ阳性细胞，利用Ａｆｐ以及ｌａｃＺ抗体进行免疫荧光 踪系统中，ｌａｃＺ ｌ５Ｈ性细胞的确也是Ａｆｐ 一 为了 定Ａｆｐ—ｃｒｅ—ｌａｃＺ转 『大ｌ小鼠 胞。 损伤或 ２．５ Ａｆｐ－ｃｒｅ－ｌａｃＺ转基因小鼠在肝损伤模型中应用 者疾病模 中是 也能够进行 ＨＪ， 、 Ｊ ２／３川 １ ÷ｌａｃＺ 绿 表 Ａｆｐ 精 表 ＤＡＰ１染料（ Ｈ色』核）；放人 数为２００ 图３ Ａｌｐ—ｅｒｅ－ｌａｃＺ转基因小鼠肝脏组织中Ａｆｐ与ｌａｃＺ免疫荧光共定位 ｒｅｄ：ｌａｃＺ，ｇｒｅｅｎ：Ａｆｐ，ｂｌｕｅ：Ｄａｐｉ；ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２００× Ｆｉｇｕｒｅ ３ Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＣＯ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｆｐ ａｎｄ ｌａｃＺ ｉｎ Ａｆｐ－ｅｒｅ．１ａｃＺ ｍｉｃｅ ｌｉｖｅｒ 除 ｌ术联合２一ＡＡＦ给药ｎ勺肝损伤模 。ｘ—ｇａ１染 结果显示，在肝切除丁 术的伤【］处，出现了ｘ—ｇａｌ 染色 ５Ｈ性的细胞（ ４）。表１１Ｊ｛Ａｆｐ—ｃｒｅ—ｌａｃＺ转坫【人１小 鼠示踪系统可以 用于肝损伤模 。 （Ａ） ２－ＡＡＦ ２－ＡＡＦ ２／３ＰＨ ２－ＡＡＦ Ｔａｍｏ ２－ＡＡＦ ２－ＡＡＦ Ｔａｍｏ 取组纵 ３讨论 本义利用传统ｆ内ＤＮＡ雄原核显微注射方法构 建丁Ａｆｐ—ｃｒｅ—ｌａｃＺ转基闪小鼠。小鼠肝组织切片的 ． ≯ … ． ｔ‘ ．． 一’ ． ｘ—ｇａｌ染色与免疫荧光共定化的结果表明，在肝脏 中，Ａｆｐ—ｃｒｅ—ｌａｃＺ转基冈小鼠示踪系统能够 确示 踪Ａｆｐ表达『５Ｈ性的细胞，同时也能够应用于肝损伤 小鼠模 中。另外，实验结果也表明，在成体肝 组织中，存在少量Ａｆｐ表达阳性细胞。 近乍Ｆ来，刈肝脏细胞的尔踪研究报道 】ｔ要 黧 ？ Ａ： 验 Ｌ桂『，．÷患 ｌ：Ｂ：Ａｆｐ—ｃｒｅ—ｌａｃＺ｛：々ｊ 小鼠Ｈ『 ｌ ｘ—ｇａｌ染 ．４００× 图４ Ａｆｐ－ｃｒｅ－ｌａｃＺ转基因小鼠肝损伤模型Ｘ．ｇａｌ染色结果 Ａ：ｓｃｈｅｍｅ ｏｆｌｉｖｍ’ｉｎｊｕｒｙ ｅｘｐｅｄｌｎｅｎｔ；Ｂ：Ｘ—ｇａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔ． ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ．４００× 集中 Ｔ细胞、实质细胞以及肌管细胞的研究， 并日｜埘其增殖分化已经有ｒ比较深入了解。＿ｌＪ于 Ａｆｐ与胚胎发育以及肿瘤发生仔在密切关联 】，冈 此， 关， ＿Ｆ常组织中Ａｆｐ阳性细胞可能与干细胞相 肝班 ｌＩ＇则可能与肿瘤细胞相关。但是在 胚胎、成年和疾病返３个时期，Ａｆｐ阳性细胞之 Ｆｉｇｕｒｅ ４ ｘ－ｇａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ２－ＡＡＦ／ＰＨ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ ０ｆ Ａｆｐ—ｃｒｅ－ｌａｃＺ ｍｉｃｅ 的关联仍未知，缺乏合适的动物模， 足一个重要的 Ａｐｒ．２０１７．３７（２） 实验动物与比较医学ＬａｂｏｒｏｒｙＡｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｒⅢ ；ｒＬ ａｔｒ｝刀 踟 ｒＬ ９３ 因。因此，作者认为利用本文所构建的Ａｆｐ—ｃｒｅ—ｌａｃＺ 转基因小鼠模型将有助于对Ａｆｐ阳性细胞在生理和 病理情况下的作用开展深入研究。 参考文献： Ｓｕｎ Ｗ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｓｈｏｕ Ｄ，ｅｔ ａ１．ＡＦＰ（ａｌｐｈａ ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）：ｗｈｏ ａｒｅ ｙｏｕ ｉｎ ｇａｓｔｒｏｌｏｇｙ？［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，２０１５，３５７（１）：４３—４６． Ｔｅｒｅｎｔｉｅｖ ＡＡ．Ｍｏｌｄｏｇａｚｉｅｖａ ＮＴ．Ａｌｐｈａ—ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ：ａ 【９】Ｐａｒｐａｒｔ Ｓ，Ｒｏｅｓｓｌｅｒ Ｓ，Ｄｏｎｇ Ｆ，ｅｔ １ａ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ一２９ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ａｌｐｈａ・－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕ．－ ｌｒ ａｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１４，６０（３）：８７２— ８８３． ［１０］ＣｈｅｎＬ，ＺｈａｎｇＷ，ＬｉｎｇＨＦ，ｅｔａａ１．ＡｃｔｉｖｉｎＡｉｎｄｕｃｅｓｇｒｏｗｔｈ ａｒｒｅｓｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ＳＭＡＤ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎ Ｓｉｇｎａｌ，２０１４，１２：１８． 【１ １］Ｚｈａｏ ＢＢ，Ｌｉ ＨＭ，Ｇａｏ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｈｅｒｂａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ”ｄｉｗｕ ｙａｎｇｇａｎ”ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｌｉｖｅｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｈｅ ｈｅ— ｔｐａｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ ２－ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｎｅ／ ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ［Ｊ］．Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ，２０１３，３４（４）：２０７５—２０９１． Ｋａｊｉｙａｍａ Ｙ，Ｔｉａｎ Ｊ，Ｌｏｃｋｅｒ Ｊ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ Ｎｋｘ２．８［Ｊ】＿Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００２，２２（１７）：６１２２— ６１３Ｏ． Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＭＬ，Ｍａ Ｃ，Ｓｐｅａｒ ＢＴ．Ｚｈｘ２ ａｎｄ Ｚｂｔｂ２０：ｎｏｖｅｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ａｌｐｈａ—ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｎｄ ａｔｈｅｉｒ ｐａｒｔｉａｌ ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｅｖｉｄ Ｂａｓｅｄ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ａｌｔｅｒｎａｔ Ｍｅｄ，２０１５，２０１５：４６８３０３． ［１２】Ｓａｕｚａｙ Ｃ，Ｐｅｔｉｔ Ａ，Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ ＡＭ，ｅｔ ａ１．Ａｌｐｈａ—ｆｏｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ （ＡＦＰ）：Ａ ｍｕｌｉｔ—ｐｕｒｐｏｓｅ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ，２０１６，４６３：３９—４４． 【１３】Ｗａｎｇ Ｂ，Ｚｈａｏ Ｌ，Ｆｉｓｈ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗｉｎｇ ｄｉｐｌｏｉｄ Ａｘｉｎ２ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｇｅｎｅ ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｉｆｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ，２０１ １，２１（１）：２１—２７． Ｎａｋａｏ Ｋ，Ｉｃｈｉｋａｗａ Ｔ．Ｒｅｃｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ ｏｎ ｌａｐｈａ—ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］． Ｈｅｐａｔｏｌ Ｒｅｓ，２０１３，４３（８）：８２０—８２５． Ｆｏｍｅｒ Ａ，Ｌｌｏｖｅｔ ＪＭ，Ｂｒｕｉｘ Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］． （＋）ｃｅｌｌｓ ｆｕｅｌ ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ ｒｅｎｅｗａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ， ２０１５，５２４（７５６４）：１８０—１８５． ［１４］ＴａｒｌｏｗＢＤ，ＦｉｎｅｇｏｌｄＭＪ，ＧｒｏｍｐｅＭ．ＣｌｏｎａｌｔｒａｃｉｎｇｏｆＳｏｘ９＋ ｌｉｖｅｒ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｏｖａｌ ｃｅｌｌ ｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ２０１４，６０（１）：２７８—２８９． 【１５】Ｍａｌａｔｏ Ｙ，Ｎａｑｖｉ Ｓ，Ｓｃｈｕｒｍａｎｎ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｆａｔｅ ｒｔａｃｉｎｇ ｏｆｍａｔｕｒｅ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｌｉｖｅｒ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｎｄ ａｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２０１ １，１２１（１２）：４８５０－４８６０． ［１６】Ｓｈｉｎ Ｓ，Ｕｐａｄｈｙａｙ Ｎ，Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ ＬＥ，ｅｔ ａ１．Ａｂｌａｔｉｏｎ ｏｆＦｏｘｌｌ— Ｃｒｅ—ｌａｂｅｌｅｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｈｅｉｔｒ ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔｓ Ｌａｎｃｅｔ，２０１２，３７９（９８２２）：１２４５－１２５５． Ｓｏｎｇ ＰＰ，Ｘｉａ ＪＦ，Ｉｎａｇａｋｉ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉｅｓ ｒｅｇａｒｄｉｎｇ ｎｄ ａｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｏｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕ— ｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｗｏｄｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２０１６，２２（１）：２６２— ２７４． Ｔａｎｇ Ｈ，Ｔａｎｇ ＸＹ，Ｌｊｕ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｌｐｈａ—ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ ｈｅ ｔｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｐａｉｒｓ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ［Ｊ】． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２０１５，１４８（１）：１９２—２０２． ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ，２００８，３９４（１）：８１—８８． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｆｐ－－ｃｒｅ・－ｌａｃＺ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ＧＵ Ｘｉａｏ－ｗｅｎ ，ＳＵＮ Ｒｅｉ—ｌｉｎ ，ＦＥＩ Ｊｉａｎ （１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｏｎｇｊｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００９２．Ｃｈｉｎａ ２．Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｂｉｏｍｏｄｅｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１２０３，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ａｆｐ）ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅｓ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｒｅｐａｉｒ ｏｒ ｉｎ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ，Ａｆｐ—ｃｒｅ—ｌａｃＺ ｌｉｎａｇｅ ｔｒａｃｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｆｐ．ＣｒｅＥＩ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ ｂｙ ｒｅａ１ ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ａｆｐ— ＣｒｅＥＲＴ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｃｒｏｓｓｅｄ ｗｉｔｈ Ｒｏｓａ２６一ｌａｃＺ ｍｉｃｅ．Ｃｒｅ￣ａｃＺ ｂｏｔｈ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｋｅｐｔ ａｓ Ａｆｐ－ｃｒｅ— ｌａｃＺ ｍｉｃｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｆｉｆｔｙ—ｓｉｘ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｂｏｍ ａｆｔｅｒ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｆｏｕｒ ｏｆ ｔｈｅｍ ｇｅｎｏｔｙｐｅｄ Ｃｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｗｅｒｅ ｋｅｐｔ ａｓ ｆｏｕｎｄｅｒ．Ｅａｃｈ ｆｏｕｎｄｅｒ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａ ｓｔｒａｉｎ．Ｃｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅａｃｈ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｉｅｄ ｆｖｉａ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｔｈｕｓ ＡｆＤ—ＣｒｅＥＲＴ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅ Ｃｒｅ／ｌａｃＺ ｂｏｔｈ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ ｏｆ Ａｆｐ—ＣｒｅＥＲＴ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｃｒｏｓｓｅｄ ｗｉｔｈ Ｒｏｓａ２６一ｌａｃＺ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｋｅｐｔ ａｓ Ａｆｐ—ｃｒｅ— ｌａｃＺ ｍｉｃｅ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｘ．ｇａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，Ａｆｐ—ｃｒｅ—ｌａｃＺ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｔｈａｔ ｈｅｙ ｔｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ １ｉｎｅａｇｅ ｒａｃｉｔｎｇ ａｎｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｈｅ Ａｆｐ．ｃｒｅ—ｌａｃＺ ｍｉｃｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｍａｙ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｌｉｎｅａｇｅ ｔｒａｃｉｎｇ ｓｔｕｄｉｅｓ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ａｌｐｈａ—ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ａｆｐ）；Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ；Ｌｉｎｅａｇｅ ｔｒａｃｉｎｇ