外周血单个核细胞分离方法

测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞,如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等;取得有活性的细胞应根据不同目的,采用不同方法,考虑1细胞纯度；2细胞获得量；3细胞活力；4使用方法的简易程度和本室条件等;目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞; 一 原理:

常用来分离人外周血单个核细胞PBMC的分层液比重是 ± 的 聚蔗糖Ficoll-泛影葡胺UrografinF／H分层液;Ficoll是蔗糖的多聚体,呈中性,犌W水性高,平均分子量为400,000,当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜;红细胞、粒细胞比重大,离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重,离心后漂浮于分层液的液面上,也可有少部分细胞悬浮在分层液中;吸取分层液液面的细胞,就可从外周血中分离到单个核细胞; 二 方法:

1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液;

2. 25000rpm离心5-10分钟,吸取上清,取肝素抗凝静脉血与等量Hank\"s液或RPMI1640充分混匀,用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上,注意保持清楚的界面;水平离心2000rpm×20分钟;

3. 离心后管内分为三层,上层为血浆和Hank\"s液,下层主要为红细胞和粒细胞;中层为淋巴细胞分离液,在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带如下图,单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞;此外,还含有血小板;

4. 用毛细血管插到云雾层,吸取单个核细胞;置入另一短中管中,加入５倍以上体积的Hank\"s液或RPMI1640,2000rpm×20分钟,洗涤细胞两次; 5. 末次离心后,弃上清,加入含有10％小牛血清的RPMI1640,重悬细胞;取一滴细胞悬液与一滴％台盼兰染液混合,于血球计数板上,计数四个大方格内的细胞总数; 单个核细胞浓度细胞数／1毫升细胞悬液＝ 4个大方格内细胞总数 ────────── × 10４×2稀释倍数 4

6. 细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色,活细胞不着色;计数200个淋巴细胞;计算出活细胞百分率;

活细胞数 活细胞百分率＝────── ×100％ 总细胞数

用本法分离PBMC,纯度在90％以上,收获率可达80～90％,活细胞百分率在95％以上; %DMSO胎牛血清冻存;