(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103952331 A(43)申请公布日 2014.07.30
(21)申请号 201410084301.7(22)申请日 2014.03.07
(83)生物保藏信息
CCTCC NO：M 2013105 2013.03.26(71)申请人上海交通大学
地址200240 上海市闵行区东川路800号(72)发明人许平 徐轲 倪俊
(74)专利代理机构上海旭诚知识产权代理有限
公司 31220
代理人郑立(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)C12P 7/56(2006.01)C12R 1/07(2006.01)
(54)发明名称
一株凝结芽孢杆菌及其在原位产物分离发酵生产乳酸钙中的应用(57)摘要
本发明公开了一株凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）H-1及利用该菌进行原位产物分离发酵生产乳酸钙的方法。本发明的菌株为凝结芽孢杆菌H-1，保藏号为CCTCC NO：M2013105。通过种子液培养，然后于50～60℃发酵50～250小时，得到高光学纯度的乳酸钙。使用原位产物分离发酵技术连续发酵，发酵罐中的产量终浓度为167～171g/L，同时可获得结晶出的乳酸钙晶体，生产速率可达5g/L/h，光学纯度可达99.7%，转化率可达0.95g/g。半连续的发酵过程可根据需要多次结合原位产物分离技术，分离过程简便、经济、高效、环保，并且可持续。利用本发明的方法发酵生产乳酸钙，能够在节约成本的同时提高生产效率，具有重要的工业应用价值。
权利要求书1页 说明书10页权利要求书1页 说明书10页
序列表1页 附图1页序列表1页 附图1页
CN 103952331 ACN 103952331 A
权 利 要 求 书
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1.一株凝结芽孢杆菌，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）H-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013105。
2.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌H-1在制备乳酸钙中的应用，其特征在于，在半连续发酵过程中结合原位产物分离技术，发酵连续生产乳酸钙。
3.一种原位产物分离发酵生产乳酸钙的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）斜面培养：将凝结芽孢杆菌H-1接种于斜面培养基上，50～60℃条件下，培养24～48小时；
（2）种子培养：将斜面培养物接种到种子培养基中，加入碳酸钙控制发酵液pH，50～60℃条件下，静止培养10～24小时，制备种子培养液；转接入发酵罐中，45～60℃，60～150rpm，培养10～20小时，制得发酵罐种子培养液；
（3）发酵培养：将发酵罐种子培养液接入发酵培养基中，在40℃～60℃环境下，控制pH为5.5～6.5，半连续发酵培养50～250小时；
（4）产物分离：在步骤（3）所述的发酵培养中，多次进行以乳酸钙为晶种的原位产物分离，直至生产速率明显下降。
4.根据权利要求3所述的原位产物分离发酵生产乳酸钙的方法，其特征在于，所述步骤（4）的以乳酸钙为晶种的原位产物分离方法是指：将糖含量低于10g/L的发酵液流入结晶槽中，降温到15～35℃后，添加2～8%（w/v）的晶种，结晶2～5小时。
5.根据权利要求4所述的原位产物分离发酵生产乳酸钙的方法，其特征在于，所述的晶种为五水乳酸钙晶体。
6.根据权利要求3所述的原位产物分离发酵生产乳酸钙的方法，其特征在于，在步骤（3）所述的半连续发酵培养中包含补料流加工艺，所述补料流加工艺是指：当发酵液中葡萄糖含量低于10g/L时，首先流出部分发酵液到所述结晶槽中用于所述原位产物分离，然后补加葡萄糖含量为400～600g/L的发酵培养基维持发酵，当所述原位产物分离步骤结束后再将所述结晶槽中的上清液流回发酵罐中，使发酵罐中的总葡萄糖含量维持在40～80g/L。
7.根据权利要求3所述的原位产物分离发酵生产乳酸钙的方法，其特征在于，发酵培养基的组分及其含量为：碳源150～500g/L、氮源5～17g/L和用于维持发酵培养基pH的中和剂200～300g/L，余量为水。
8.根据权利要求7所述的原位产物分离发酵生产乳酸钙的方法，其特征在于，所述的氮源为酵母粉、大豆蛋白胨、棉籽蛋白、硝酸铵和氯化铵，具体为酵母粉2～12g/L，大豆蛋白胨1～3g/L，棉籽蛋白1～3g/L，硝酸铵0.5～2g/L，氯化铵0.5～2g/L。
9.根据权利要求7所述的原位产物分离发酵生产乳酸钙的方法，其特征在于，所述用于维持发酵培养基pH的中和剂为氢氧化钙，培养体系pH为在5.5～6.5。
10.根据权利要求3所述的原位产物分离发酵生产乳酸钙的方法，其特征在于，所述半连续发酵和所述原位产物分离过程均为开放式。
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说 明 书
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一株凝结芽孢杆菌及其在原位产物分离发酵生产乳酸钙中
的应用
技术领域
本发明属于生物发酵工程技术领域中乳酸钙的生产方法，尤其是涉及一株凝结芽
孢杆菌、及利用该菌进行开放式原位产物分离发酵连续生产光学纯乳酸钙的方法。
[0001]
背景技术
乳酸（Lactic Acid），又名α－羟基丙酸，根据旋光性不同可分为L－乳酸（左旋性）、D－乳酸（右旋性）和消旋乳酸。乳酸是一种多用途的有机酸，可广泛应用于食品、医药、化工、印染等领域。其中，最重要、最广泛的工业应用是作为聚乳酸合成的单体。聚乳酸具有良好的生物可降解性和生物相容性，不仅在当今石油资源日益短缺的情况下很有希望成为石油基塑料的替代品，也被产业界认为一种最有发展前途的新型医学材料。因此光学纯L－乳酸的生产有着重要的意义。
[0003] 乳酸钙是一种重要的食品添加剂，广泛应用于乳制品、保健品、饮料等领域。乳酸钙可用作营养强化剂来补充钙元素，相对其他钙类更容易被人体吸收，对预防佝偻病、缺钙症、手足抽搐症等有重要意义。乳酸钙可作为膨松剂和缓冲剂应用于面包、糕点、奶粉和腌制品等的制作。此外，乳酸钙是一种安全有效的固化剂，可应用于新鲜切割的蔬菜和肉类的保鲜方面。乳酸钙可由生产出的乳酸进行酸碱反应来制备，也可由使用氢氧化钙或者碳酸钙调节pH的乳酸发酵过程直接获得。
[0004] 乳酸的生产方法主要有微生物发酵法、化学合成法和酶催化法。作为大规模生产中最主要的生产方法，微生物发酵法可以用纤维素、淀粉等可再生资源的水解液作为原料生产乳酸，通过使用不同的菌株可获得光学纯的L－乳酸、D－乳酸或是两者的混合物，其生产成本低，产品安全性高，并且环境污染小。凝结芽孢杆菌是一种耐热的可发酵生产光学纯L－乳酸的微生物，可以实现在较高温度（45～60℃）条件下的开放式发酵，很大程度上降低发酵过程中污染杂菌的可能性，保证了终产物的高光学纯度。此外，凝结芽孢杆菌的营养要求低，可以非常经济的进行大规模的发酵生产。
[0005] 目前大规模的乳酸发酵基本采用分批发酵模式，这种发酵模式技术要求低、操作简便、产物终浓度高，但在生产过程中发酵罐的利用率偏低：分批发酵在每次发酵开始前的培养基配制、升温等准备工作需要占用一定的时间；发酵结束时，发酵液的处理、排放、罐体的清洗等也会占用较长时间，这都极大降低了发酵罐的利用率，从而提高了生产成本。此外，为了配合分批发酵需要不断的进行种子液的制备， 制种过程的原料和能源消耗也会提高生产成本。半连续发酵方法和全细胞回收的重复发酵方法可以极大的提高发酵罐的利用率，通过直接利用前一批次中的大量菌体可以持续的进行多个批次的发酵，无需重复进行种子的制作。
[0002]
持续的获得高浓度的发酵终产物可以让整个生产过程更经济，尤其是对耗能较高
的产物浓缩步骤。在普通的分批发酵方式中，终产物只能在发酵结束时一次性获得，这很可能会对后处理过程带来因发酵过程本身所需的时间上的延误。原位产物分离发酵是一种将
[0006]
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后处理过程中的产物分离技术应用在发酵过程中的发酵模式，可在发酵进行的同时不断的分离出终产物。常见的原位产物分离发酵一般采取电渗析、离子交换、有机溶剂萃取等产物分离技术，这些分离技术有的对设备要求高，有的对发酵所用的微生物有细胞毒性，还有的会造成大量的底物损失，在工业生产的应用中存在一定的局限性。[0007] 因此，本领域技术人员致力于开发一种原位产物分离发酵生产乳酸钙的方法，以简化操作、缩短生产时间、降低生产成本。发明内容
有鉴于现有技术中常见的电渗析、离子交换、有机溶剂萃取等产物分离技术，对设备要求高、对发酵所用的微生物有细胞毒性、或会造成大量的底物损失、在工业生产的应用中存在一定的局限性等缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种开放式原位产物分离发酵生产乳酸钙的方法，以葡萄糖作为发酵培养基的碳源，通过在开放式半连续发酵模式的基础上结合了以乳酸钙结晶为原理的原位产物分离技术来持续高效的进行乳酸钙的生产，最终获得高光学纯乳酸钙，在节约成本的同时明显的提高了生产效率，适合于工业生产中推广应用。
[0009] 本发明通过以下技术方案解决解决上述技术问题：[0010] 提供一株凝结芽孢杆菌，该凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)H-1，于2013年3月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国 武汉 武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2013105。通过16S rRNA分析，可知该菌株为凝结芽孢杆菌，具体的16S rRNA序列如序列表。[0011] 进一步地，凝结芽孢杆菌H-1在制备乳酸钙中的应用，即在半连续发酵过程中结合原位产物分离技术，发酵连续生产乳酸钙。
[0012] 本发明还提供一种原位产物分离发酵生产乳酸钙的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0013] （1）斜面培养：将凝结芽孢杆菌H-1接种于斜面培养基上，50～60℃条件下，培养24～48小时；优选地，将凝结芽孢杆菌H-1接种于含有15g/L琼脂的固体斜面培养基上，50～60℃条件下，培养18～36小时；[0014] （2）种子培养：将斜面培养物接种到种子培养基中，加入碳酸钙控制发 酵液pH，50～60℃条件下，静止培养10～24小时，制备种子培养液；转接入发酵罐中，45～60℃，60～150rpm，培养10～20小时，制得发酵罐种子培养液；优选地，种子培养是指：将经过斜面培养的凝结芽孢杆菌在无菌条件下接种到20～40mL种子培养基中，50～60℃条件下，加入中和剂维持pH为5.5～6.5条件下，静止培养15～24小时；以10%（v/v）接种量同样条件扩增到200～400mL后全部转入含2～3L种子培养基的5升发酵罐中，50～60℃，60～100rpm，加入中和剂维持发酵液pH为5.5～6.5，在此条件下培养10～20小时，制得发酵罐种子培养液；[0015] （3）发酵培养：将发酵罐种子培养液接入发酵培养基中，在40℃～60℃环境下，控制pH为5.5～6.5，半连续发酵培养50～250小时；[0016] （4）产物分离：在步骤（3）所述的发酵培养中，多次进行以乳酸钙为晶种的原位产物分离，直至生产速率明显下降。
[0008]
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优选地，步骤（3）的发酵培养采用发酵培养基，按15～25％（v/v）的接种量接入
发酵罐种子培养液中。其中，温度优选50℃～55℃，接种量优选20～25％（v/v）。[0018] 进一步地，步骤（4）的以乳酸钙为晶种的原位产物分离方法是指：将糖含量低于10g/L的发酵液流入结晶槽中，降温到15～35℃后，添加2～8%（w/v）的晶种，结晶2～5小时。
[0019] 进一步地，步骤（3）的半连续发酵工艺是指：当发酵液中葡萄糖剩余0～10g/L时取出40～60%（v/v）的发酵液在结晶槽中进行乳酸钙分离，然后补加20～30%（v/v）的葡萄糖含量为500g/L的发酵培养基继续发酵，2～5小时后将结晶槽中的上清液回流到发酵罐中，原位产物分离步骤结束后向发酵罐中补充50g/L的葡萄糖，继续发酵直至发酵罐中的葡萄糖耗尽。[0020] 进一步地，晶种为五水乳酸钙晶体。[0021] 进一步地，在步骤（3）半连续发酵培养中包含补料流加工艺，该补料流加工艺是指：当发酵液中葡萄糖含量低于10g/L时，首先流出部分发酵液到所述结晶槽中用于所述原位产物分离，然后补加葡萄糖含量为400～600g/L的发酵培养基维持发酵，当所述原位产物分离步骤结束后再将所述结晶槽中的上清液流回发酵罐中，使发酵罐中的总葡萄糖含量维持在40～80g/L。[0022] 进一步地，发酵培养基的组分及其含量为：碳源150～500g/L、氮源5～17g/L和用于维持发酵培养基pH的中和剂200～300g/L，余量为水。[0023] 进一步地，氮源为酵母粉、大豆蛋白胨、棉籽蛋白、硝酸铵和氯化铵，具体为酵母粉2～12g/L，大豆蛋白胨1～3g/L，棉籽蛋白1～3g/L，硝酸铵0.5～2g/L，氯化铵0.5～2g/L。
[0024] 进一步地，种子培养基含有：葡萄糖50～100g/L，酵母粉5～10g/L，蛋白胨1～5g/L，余量为水。优选含有：葡萄糖80g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，余 量为水；该种子培养基的pH为6.0。[0025] 进一步地，用于维持发酵培养基pH的中和剂为碳酸钙或氢氧化钙，培养体系pH为在5.5～6.5。优选地，碳酸钙浓度为40g/L，氢氧化钙浓度为200～300g/L。[0026] 进一步地，所述半连续发酵和所述原位产物分离过程均为开放式。[0027] 其中，葡萄糖的测定方法为，发酵液稀释到所需浓度范围后离心，采用生物传感分析仪SBA-40D（山东省科学院）测定。生物传感分析仪SBA-40D是以固定化酶为传感器的分析仪器，测定时葡萄糖与氧气、水在酶的催化下生成双氧水，双氧水与白金－银电极接触，并产生电流信号，该电流信号与葡萄糖浓度成线性比例关系，通过测定电流信号强度可得出葡萄糖浓度。
[0028] L－乳酸和D－乳酸浓度（g/L）的测定方法为：使用Agilent1100液相色谱分析仪，配备手性分离柱（日本三菱化学公司，MCI GEL-CRS10W(3μ)4.6ID×50mm，分离光学异构体）。操作条件为：2mM硫酸铜作为流动相，流量0.5mL/min，进样量20μL，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度25℃。利用L－乳酸和D－乳酸标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液中L-乳酸和D-乳酸的含量。[0029] 本发明中，作为标准品的D－乳酸为德国Sigma-Aldrich公司的产品，其货号为L0625-25MG；作为标准品的L－乳酸为德国Sigma-Aldrich公司的产品，其货号为
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L1750-10G。
[0030] 光学纯度（optical purity）是衡量旋光性样品中一个对映体超过另一个对映体的量的量度，它可用对映体过量值（enantiomeric excess，ee）表示。本发明中乳酸的光学纯度（ee），以L－乳酸为例以下公式计算：
[0031]
[0032]
[0033]
本发明主要是在半连续发酵基础上结合以乳酸钙结晶为原理的原位产物分离方法来进行乳酸钙的生产。通过半连续发酵提供经济的，有较好持续能力的发酵过程，结合乳酸钙结晶这种廉价、易操作的分离方式不断的获得乳酸钙晶体。此外，整个发酵过程采用不灭菌的开放式发酵，可以节省因发酵培养基灭菌过程所致的时间和能源成本消耗。本发明提供的发酵方法使得乳酸钙的生产工艺不仅操作简单，成本低廉，产物浓度高，而且有较高的持续生产能力。利用葡萄糖作碳源时，该发酵方法的乳酸生产强度可达5.0g/L/h，多次的偶联结晶法的分离对发酵速度几乎无 影响，分离出的乳酸钙为固态结晶，使得产物在后处理时更方便也更经济，且发酵结束时发酵罐中的乳酸浓度最高可达168g/L。
[0034]
本发明所使用的凝结芽孢杆菌H-1可在50～60℃条件下进行L－乳酸钙发酵，营养要求低，且生产L－乳酸钙的能力强。利用葡萄糖作碳源时L－乳酸钙光学纯度可达99.5%，糖酸转化率最高可达0.95g/g。本发明所提供的凝结芽孢杆菌在长时间半连续发酵中菌株不退化，仍能保持较高的活力。因此，利用本发明方法生产乳酸钙，能提高生产效率、节约成本，适合在工业生产中推广应用。
[0036] 以下将结合附图对本发明的技术方案作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
[0035]
附图说明
[0037] 图1是本发明利用原位产物分离发酵连续生产乳酸钙方法的图示。BR：发酵罐。FT：补料罐。C：结晶槽。具体实施方式
[0038]
如图1所示，本发明利用开放式原位产物分离发酵连续生产乳酸钙方法的主要流程为：将凝结芽孢杆菌H-1进行培养获得种子培养液；将种子培养液接种入发酵罐中进行半连续发酵培养；在半连续发酵培养中，进行A：取出一定量发酵液进行结晶；B：从补料罐补充发酵培养基；C：将结晶后的上清液流回发酵罐中；D：从补料罐补充葡萄糖粉；多次进行以乳酸钙为晶种的原位产物分离，直至生产速率明显下降。
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具体实施方式中，使用凝结芽孢杆菌H-1，利用开放式原位产物分离发酵技术在5
升发酵罐中生产光学纯L－乳酸钙。[0040] 实施例1
[0041] 本实施例中所用的培养基的组成如下：[0042] 斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，大豆蛋白胨5g/L，碳酸钙5g/L，琼脂粉15g/L，pH为6.0。
[0043] 种子培养基：葡萄糖80g/L，酵母粉10g/L，大豆蛋白胨5g/L，pH为6.0。[0044] 发酵培养基：葡萄糖200g/L，酵母粉12.6g/L，大豆蛋白胨1.2g/L，棉籽蛋白3g/L，硝酸钠1g/L，氯化铵1g/L，pH为6.2。
[0045] 用本发明开放式原位产物分离发酵法生产光学纯L－乳酸钙的步骤如下：[0046] （1）斜面培养：将凝结芽孢杆菌H-1接种于斜面培养基上，50～60℃条件下，培养24～48小时。[0047] （2）种子培养：将步骤（1）的斜面培养物，在无菌条件下接种到30mL种子培养基中，加入40g/L碳酸钙控制发酵液pH，50～60℃条件下，静止培养10～ 24小时；以10%（v/v）转接入300mL种子培养基中，用相同方法培养；以10%（v/v）转接入含2～3L种子培养基的5升发酵罐中，45～60℃，60～100rpm，用20～30%（w/v）的氢氧化钙维持发酵液pH为5.5～6.5，在此条件下培养10～20小时，制得种子培养液。[0048] （3）发酵培养：将步骤（2）制得的种子液以20～30％（v/v）的接种量接种于发酵培养基中，40～60℃，60～100rpm，用20～30%（w/v）的氢氧化钙维持发酵液pH为5.5～6.5，在此条件下培养48～72小时。期间，残糖为0～10g/L时取出40～60%（v/v）的发酵液进行乳酸钙的原位分离，同时补加20～30%（v/v）的葡萄糖含量为500g/L的发酵培养基，2～4小时后将结晶槽中的上清液回流到发酵罐中，产物分离步骤结束后向发酵罐中补充50g/L的葡萄糖，继续发酵直至发酵罐中的葡萄糖耗尽。[0049] （4）产物分离：将步骤（3）中取出的发酵液冷却至15～20℃，添加2～4%（w/v）的乳酸钙作为晶种，静置2～3小时后，将上清液流回发酵罐中继续进行发酵，析出的乳酸钙晶体作为终产物用于后处理。一共进行三轮原位产物分离。[0050] 其中，步骤（1）、（2）、（3）中所述的菌体培养温度优选是50～55℃。[0051] 上述发酵培养过程中，每4个小时取发酵液，先加热至80～100℃，再6,000rpm离心5分钟，取上清液用蒸馏水稀释到合适浓度范围后检测发酵液中L－乳酸浓度、D－乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算糖酸转化率、L－乳酸产酸速率和L－乳酸光学纯度。[0052] 结果表明：5升罐中H-1生产L－乳酸浓度为169g/L，在结晶槽中进行的三轮产物分离共获得415g L－乳酸钙结晶，发酵时间为69小时，L－乳酸生产速率为4.3g/L/h，糖酸转化率为0.93g/g，光学纯度为99.6%。[0053] 实施例2
[0054] 本实施例中所用的培养基的组成如下：[0055] 斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，大豆蛋白胨5g/L，碳酸钙5g/L，琼脂粉15g/L，pH为6.0。
[0056] 种子培养基：葡萄糖80g/L，酵母粉10g/L，大豆蛋白胨5g/L，pH为6.0。[0057] 发酵培养基：葡萄糖200g/L，酵母粉12.6g/L，大豆蛋白胨1.2g/L，棉籽蛋白3g/L，
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硝酸钠1g/L，氯化铵1g/L，pH为6.2。
[0058] 用本发明开放式原位产物分离发酵法生产光学纯L－乳酸钙的步骤如下：[0059] （1）斜面培养：将凝结芽孢杆菌H-1接种于斜面培养基上，50～60℃条件下，培养24～48小时。[0060] （2）种子培养：将步骤（1）的斜面培养物，在无菌条件下接种到30mL种子培养基中，加入40g/L碳酸钙控制发酵液pH，50～60℃条件下，静止培养10～ 24小时；以10%（v/v）转接入300mL种子培养基中，用相同方法培养；以10%（v/v）转接入含2～3L种子培养基的5升发酵罐中，45～60℃，60～100rpm，用20～30%（w/v）的氢氧化钙维持发酵液pH为5.5～6.5，在此条件下培养10～20小时，制得种子培养液。[0061] （3）发酵培养：将步骤（2）制得的种子液以20～30％（v/v）的接种量接种于发酵培养基中，40～60℃，60～100rpm，用20～30%（w/v）的氢氧化钙维持发酵液pH为5.5～6.5，在此条件下培养48～72小时。期间，残糖为0～10g/L时取出40～60%（v/v）的发酵液进行乳酸钙的分离，同时补加20～30%（v/v）的葡萄糖含量为500g/L的发酵培养基，2～4小时后将结晶槽中的上清液回流到发酵罐中，原位产物分离步骤结束后向发酵罐中补充50g/L的葡萄糖，继续发酵直至发酵罐中的葡萄糖耗尽。[0062] （4）产物分离：将步骤（3）中取出的发酵液冷却至15～20℃，添加5～8%（w/v）的乳酸钙作为晶种，静置2～3小时后，将上清液流回发酵罐中继续进行发酵，析出的乳酸钙晶体作为终产物用于后处理。一共进行三轮原位产物分离。[0063] 其中，步骤（1）、（2）、（3）中所述的菌体培养温度优选是50～55℃。[0064] 上述发酵培养过程中，每4个小时取发酵液，先加热至80～100℃，再6,000rpm离心5分钟，取上清液用蒸馏水稀释到合适浓度范围后检测发酵液中L－乳酸浓度、D－乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算糖酸转化率、L－乳酸产酸速率和L－乳酸光学纯度。[0065] 结果表明：5升罐中H-1生产L-乳酸浓度为168g/L，在结晶槽中进行的三轮原位产物分离共获得525g L－乳酸钙结晶，发酵时间为65小时，L-乳酸生产速率为5g/L/h，糖酸转化率为0.93g/g，光学纯度为99.5%。[0066] 实施例3
[0067] 本实施例中所用的培养基的组成如下：[0068] 斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，大豆蛋白胨5g/L，碳酸钙5g/L，琼脂粉15g/L，pH为6.0。
[0069] 种子培养基：葡萄糖80g/L，酵母粉10g/L，大豆蛋白胨5g/L，pH为6.0。[0070] 发酵培养基：葡萄糖200g/L，酵母粉12.6g/L，大豆蛋白胨1.2g/L，棉籽蛋白3g/L，硝酸钠1g/L，氯化铵1g/L，pH为6.2。
[0071] 用本发明开放式原位产物分离发酵法生产光学纯L－乳酸钙的步骤如下：[0072] （1）斜面培养：将凝结芽孢杆菌H-1接种于斜面培养基上，50～60℃条件下，培养24～48小时。[0073] （2）种子培养：将步骤（1）的斜面培养物，在无菌条件下接种到30mL种子培养基中，加入40g/L碳酸钙控制发酵液pH，50～60℃条件下，静止培养10～ 24小时；以10%（v/v）转接入300mL种子培养基中，用相同方法培养；以10%（v/v）转接入含2～3L种子培养基的5升发酵罐中，45～60℃，60～100rpm，用20～30%（w/v）的氢氧化钙维持发酵
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液pH为5.5～6.5，在此条件下培养10～20小时，制得种子培养液。[0074] （3）发酵培养：将步骤（2）制得的种子液以20～30％（v/v）的接种量接种于发酵培养基中，40～60℃，60～100rpm，用20～30%（w/v）的氢氧化钙维持发酵液pH为5.5～6.5，在此条件下培养48～72小时。期间，残糖为0～10g/L时取出40～60%（v/v）的发酵液进行乳酸钙的分离，同时补加20～30%（v/v）的葡萄糖含量为500g/L的发酵培养基，2～4小时后将结晶槽中的上清液回流到发酵罐中，产物分离步骤结束后向发酵罐中补充50g/L的葡萄糖，继续发酵直至发酵罐中的葡萄糖耗尽。[0075] （4）产物分离：将步骤（3）中取出的发酵液冷却至30～35℃，添加5～8%（w/v）的乳酸钙作为晶种，静置2～3小时后，将上清液流回发酵罐中继续进行发酵，析出的乳酸钙晶体作为终产物用于后处理。一共进行三轮原位产物分离。[0076] 其中，步骤（1）、（2）、（3）中所述的菌体培养温度优选是50～55℃。[0077] 上述发酵培养过程中，每4个小时取发酵液，先加热至80～100℃，再6,000rpm离心5分钟，取上清液用蒸馏水稀释到合适浓度范围后检测发酵液中L－乳酸浓度、D－乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算糖酸转化率、L－乳酸产酸速率和L－乳酸光学纯度。[0078] 结果表明：5升罐中H-1生产L-乳酸浓度为166g/L，在结晶槽中进行的三轮原位产物分离共获得370g L－乳酸钙结晶，发酵时间为70小时，L-乳酸生产速率为4.1g/L/h，糖酸转化率为0.94g/g，光学纯度为99.5%。实施例4
[0080] 本实施例中所用的培养基的组成如下：[0081] 斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，大豆蛋白胨5g/L，碳酸钙5g/L，琼脂粉15g/L，pH为6.0。
[0082] 种子培养基：葡萄糖80g/L，酵母粉10g/L，大豆蛋白胨5g/L，pH为6.0。[0083] 发酵培养基：葡萄糖200g/L，酵母粉12.6g/L，大豆蛋白胨1.2g/L，棉籽蛋白3g/L，硝酸钠1g/L，氯化铵1g/L，pH为6.2。
[0084] 用本发明开放式原位产物分离发酵法生产光学纯L－乳酸钙的步骤如下：[0085] （1）斜面培养：将凝结芽孢杆菌H-1接种于斜面培养基上，50～60℃条件下，培养24～48小时。[0086] （2）种子培养：将步骤（1）的斜面培养物，在无菌条件下接种到30mL种子培养基中，加入40g/L碳酸钙控制发酵液pH，50～60℃条件下，静止培养10～ 24小时；以10%（v/v）转接入300mL种子培养基中，用相同方法培养；以10%（v/v）转接入含2～3L种子培养基的5升发酵罐中，45～60℃，60～100rpm，用20～30%（w/v）的氢氧化钙维持发酵液pH为5.5～6.5，在此条件下培养10～20小时，制得种子培养液。[0087] （3）发酵培养：将步骤（2）制得的种子液以20～30％（v/v）的接种量接种于发酵培养基中，40～60℃，60～100rpm，用20～30%（w/v）的氢氧化钙维持发酵液pH为5.5～6.5，在此条件下培养48～72小时。期间，残糖为0～10g/L时取出40～60%（v/v）的发酵液进行乳酸钙的分离，同时补加20～30%（v/v）的葡萄糖含量为500g/L的发酵培养基，2～4小时后将结晶槽中的上清液回流到发酵罐中，产物分离步骤结束后向发酵罐中补充50g/L的葡萄糖，继续发酵直至发酵罐中的葡萄糖耗尽。
[0079]
[0088] （4）产物分离：将步骤（3）中取出的发酵液冷却至15～20℃，添加5～8%（w/v）
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的乳酸钙作为晶种，静置4～5小时后，将上清液流回发酵罐中继续进行发酵，析出的乳酸钙晶体作为终产物用于后处理。一共进行三轮原位产物分离。[0089] 其中，步骤（1）、（2）、（3）中所述的菌体培养温度优选是50～55℃。[0090] 上述发酵培养过程中，每4个小时取发酵液，先加热至80～100℃，再6,000rpm离心5分钟，取上清液用蒸馏水稀释到合适浓度范围后检测发酵液中L－乳酸浓度、D－乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算糖酸转化率、L－乳酸产酸速率和L－乳酸光学纯度。[0091] 结果表明：5升罐中H-1生产L-乳酸浓度为167g/L，在结晶槽中进行的三轮原位产物分离共获得546g L－乳酸钙结晶，发酵时间为67小时，L-乳酸生产速率为4.9g/L/h，糖酸转化率为0.93g/g，光学纯度为99.4%。[0092] 实施例5
[0093] 本实施例中所用的培养基的组成如下：[0094] 斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，大豆蛋白胨5g/L，碳酸钙5g/L，琼脂粉15g/L，pH为6.0。
[0095] 种子培养基：葡萄糖80g/L，酵母粉10g/L，大豆蛋白胨5g/L，pH为6.0。[0096] 发酵培养基：葡萄糖200g/L，酵母粉12.6g/L，大豆蛋白胨1.2g/L，棉籽蛋白3g/L，硝酸钠1g/L，氯化铵1g/L，pH为6.2。
[0097] 用本发明开放式原位产物分离发酵法生产光学纯L－乳酸钙的步骤如下：[0098] （1）斜面培养：将凝结芽孢杆菌H-1接种于斜面培养基上，50～60℃条件下，培养24～48小时。[0099] （2）种子培养：将步骤（1）的斜面培养物，在无菌条件下接种到30mL种子培养基中，加入40g/L碳酸钙控制发酵液pH，50～60℃条件下，静止培养10～ 24小时；以10%（v/v）转接入300mL种子培养基中，用相同方法培养；以10%（v/v）转接入含2～3L种子培养基的5升发酵罐中，45～60℃，60～100rpm，用20～30%（w/v）的氢氧化钙维持发酵液pH为5.5～6.5，在此条件下培养10～20小时，制得种子培养液。[0100] （3）发酵培养：将步骤（2）制得的种子液以20～30％（v/v）的接种量接种于发酵培养基中，40～60℃，60～100rpm，用20～30%（w/v）的氢氧化钙维持发酵液pH为5.5～6.5，在此条件下培养48～72小时。期间，残糖为0～10g/L时取出40～60%（v/v）的发酵液进行乳酸钙的分离，同时补加20～30%（v/v）的葡萄糖含量为500g/L的发酵培养基，2～4小时后将结晶槽中的上清液回流到发酵罐中，产物分离步骤结束后向发酵罐中补充50g/L的葡萄糖，继续发酵直至发酵罐中的葡萄糖耗尽。
[0101] （4）产物分离：将步骤（3）中取出的发酵液冷却至15～20℃，添加5～8%（w/v）
的乳酸钙作为晶种，静置2～3小时后，将上清液流回发酵罐中继续进行发酵，析出的乳酸钙晶体作为终产物用于后处理。一共进行六轮原位产物分离。[0102] 其中，步骤（1）、（2）、（3）中所述的菌体培养温度优选是50～55℃。[0103] 上述发酵培养过程中，每4个小时取发酵液，先加热至80～100℃，再6,000rpm离心5分钟，取上清液用蒸馏水稀释到合适浓度范围后检测发酵液中L－乳酸浓度、D－乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算糖酸转化率、L－乳酸产酸速率和L－乳酸光学纯度。[0104] 结果表明：5升罐中H-1生产L-乳酸浓度为168g/L，在结晶槽中进行的三轮原位产物分离共获得1065g L－乳酸钙结晶，发酵时间为97小时，L-乳酸生产速率为4.9g/L/
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h，糖酸转化率为0.92g/g，光学纯度为99.7%。[0105] 实施例6
[0106] 本实施例中所用的培养基的组成如下：[0107] 斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，大豆蛋白胨5g/L，碳酸钙5g/L，琼脂粉15g/L，pH为6.0。
[0108] 种子培养基：葡萄糖80g/L，酵母粉10g/L，大豆蛋白胨5g/L，pH为6.0。[0109] 发酵培养基：葡萄糖200g/L，酵母粉3g/L，大豆蛋白胨1g/L，棉籽蛋白1g/L，硝酸钠1g/L，氯化铵1g/L，pH为6.2。
[0110] 用本发明开放式原位产物分离发酵法生产光学纯L－乳酸钙的步骤如下：[0111] （1）斜面培养：将凝结芽孢杆菌H-1接种于斜面培养基上，50～60℃条件下，培养24～48小时。[0112] （2）种子培养：将步骤（1）的斜面培养物，在无菌条件下接种到30mL种子培养基中，加入40g/L碳酸钙控制发酵液pH，50～60℃条件下，静止培养10～ 24小时；以10%（v/v）转接入300mL种子培养基中，用相同方法培养；以10%（v/v）转接入含2～3L种子培养基的5升发酵罐中，45～60℃，60～100rpm，用20～30%（w/v）的氢氧化钙维持发酵液pH为5.5～6.5，在此条件下培养10～20小时，制得种子培养液。
[0113] （3）发酵培养：将步骤（2）制得的种子液以20～30％（v/v）的接种量接种于发酵
培养基中，40～60℃，60～100rpm，用20～30%（w/v）的氢氧化钙维持发酵液pH为5.5～6.5，在此条件下培养48～72小时。期间，残糖为0～10g/L时取出40～60%（v/v）的发酵液进行乳酸钙的分离，同时补加20～30%（v/v）的葡萄糖含量为500g/L的发酵培养基，2～4小时后将结晶槽中的上清液回流到发酵罐中，产物分离步骤结束后向发酵罐中补充50g/L的葡萄糖，继续发酵直至发酵罐中的葡萄糖耗尽。[0114] （4）产物分离：将步骤（3）中取出的发酵液冷却至15～20℃，添加5～8%（w/v）的乳酸钙作为晶种，静置2～3小时后，将上清液流回发酵罐中继续进行发酵，析出的乳酸钙晶体作为终产物用于后处理。一共进行三轮原位产物分离。[0115] 其中，步骤（1）、（2）、（3）中所述的菌体培养温度优选是50～55℃。[0116] 上述发酵培养过程中，每4个小时取发酵液，先加热至80～100℃，再6,000rpm离心5分钟，取上清液用蒸馏水稀释到合适浓度范围后检测发酵液中L－乳酸浓度、D－乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算糖酸转化率、L－乳酸产酸速率和L－乳酸光学纯度。[0117] 结果表明：5升罐中H-1生产L-乳酸浓度为171g/L，在结晶槽中进行的三轮原位产物分离共获得532g L－乳酸钙结晶，发酵时间为122小时，L-乳酸生产速率为2.5g/L/h，糖酸转化率为0.96g/g，光学纯度为99.5%。[0118] 实施例7
[0119] 本实施例中所用的培养基的组成如下：[0120] 斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，大豆蛋白胨5g/L，碳酸钙5g/L，琼脂粉15g/L，pH为6.0。种子培养基：葡萄糖80g/L，酵母粉10g/L，大豆蛋白胨5g/L，pH为6.0。[0122] 发酵培养基：葡萄糖200g/L，酵母粉3g/L，大豆蛋白胨1g/L，棉籽蛋白1g/L，硝酸钠1g/L，氯化铵1g/L，pH为6.2。
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用本发明开放式原位产物分离发酵法生产光学纯L－乳酸钙的步骤如下：
[0124] （1）斜面培养：将凝结芽孢杆菌H-1接种于斜面培养基上，50～60℃条件下，培养24～48小时。[0125] （2）种子培养：将步骤（1）的斜面培养物，在无菌条件下接种到30mL种子培养基中，加入40g/L碳酸钙控制发酵液pH，50～60℃条件下，静止培养10～ 24小时；以10%（v/v）转接入300mL种子培养基中，用相同方法培养；以10%（v/v）转接入含2～3L种子培养基的5升发酵罐中，45～60℃，60～100rpm，用20～30%（w/v）的氢氧化钙维持发酵液pH为5.5～6.5，在此条件下培养10～20小时，制得种子培养液。[0126] （3）发酵培养：将步骤（2）制得的种子液以20～30％（v/v）的接种量接种于发酵培养基中，40～60℃，60～100rpm，用20～30%（w/v）的氢氧化钙维持发酵液pH为5.5～6.5，在此条件下培养48～72小时。期间，残糖为0～10g/L时取出40～60%（v/v）的发酵液进行乳酸钙的分离，同时补加20～30%（v/v）的葡萄糖含量为500g/L的发酵培养基，2～4小时后将结晶槽中的上清液回流到发酵罐中，产物分离步骤结束后向发酵罐中补充50g/L的葡萄糖，继续发酵直至发酵罐中的葡萄糖耗尽。[0127] （4）产物分离：将步骤（3）中取出的发酵液冷却至15～20℃，添加5～8%（w/v）的乳酸钙作为晶种，静置2～3小时后，将上清液流回发酵罐中继续进行发酵，析出的乳酸钙晶体作为终产物用于后处理。一共进行六轮原位产物分离。
其中，步骤（1）、（2）、（3）中所述的菌体培养温度优选是50～55℃。
[0129] 上述发酵培养过程中，每4个小时取发酵液，先加热至80～100℃，再6,000rpm离心5分钟，取上清液用蒸馏水稀释到合适浓度范围后检测发酵液中L－乳酸浓度、D－乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算糖酸转化率、L－乳酸产酸速率和L－乳酸光学纯度。[0130] 结果表明：5升罐中H-1生产L－乳酸浓度为170g/L，在结晶槽中进行的三轮原位产物分离共获得1070g L－乳酸钙结晶，发酵时间为217小时，L－乳酸生产速率为2.2g/L/h，糖酸转化率为0.95g/g，光学纯度为99.6%。
[0131] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
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说 明 书 附 图
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图1
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