凡纳滨对虾育苗水环境的细菌学初探

集美大学学报(自然科学版)

JournalofJimeiUniversity(NaturalScience)

Vol.12　No.4Oct.2007

　　2007年10月

[文章编号]1007-7405(2007)04-0289-05

凡纳滨对虾育苗水环境的细菌学初探

苏国成1,2,周常义1,2

(1.集美大学生物工程学院,福建厦门361021;2.福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室,福建厦门361021)

[摘要]通过对凡纳滨对虾育苗过程中细菌的数量、组成以及部分水质因子进行全程跟踪检测,分析

了甲醛和抗生素对育苗水体细菌的影响,研究了蛭弧菌微生态制剂的水质调节效果.结果表明,使用甲醛和抗生素不能有效控制育苗水体的细菌总数,但能改变水体的优势菌群和组成,保持水体蛭弧菌的优势地位对控制细菌总数有较为明显的效果.

[关键词]凡纳滨对虾;育苗;细菌;甲醛;抗生素;蛭弧菌[中图分类号]S91711

[文献标志码]A

0　引言

我国部分近岸、河口及内湾海域由于污染物排放量增加,水体呈一定程度的富营养化,导致赤潮频繁发生,使渔业资源和水产养殖受到很大损害[1].随着自然海域水质的不断恶化,为了提高对虾育苗存活率,在生产实践中,其工艺和技术也逐步改变.其中,最主要的变化在于抗生素的普遍应用,以及为改善和控制育苗水质而采取的少量水交换技术.因此,本文旨对新形势下育苗池水体中的微生物进行调查,研究采用消毒剂、抗生素和微生态制剂对凡纳滨对虾育苗水体中的细菌总数及组成变化的影响,探讨育苗池水体中细菌的抗药情况,以期针对性选择用药,建立正确的凡纳滨对虾育苗技术,以减轻因药物滥用而对环境造成的危害,对指导凡纳滨对虾育苗生产具有实践意义.

1　材料和方法

111　实验地点和时间

实验地点位于厦门海沧区吴冠对虾育苗场,对虾育苗池大小规格为4100m×5100m×1180m～4100m×6100m×1180m,并对育苗池进行编号.实验时间为2006年2月至2006年6月的春季育苗期.112　凡纳滨对虾育苗池水环境管理

本实验育苗池中,凡纳滨对虾幼体各不同发育阶段所用的饵料主要为:骨条藻(Skeletonema

costatum)、直链藻(Melosiragranulate)、螺旋藻(Spirulinaplatensis)、虾片、配合饲料等,投饵次

数为每间隔2～6h投喂一次.

育苗池所需海水取自金厦海峡附近海域,靠载水船运至厦门海沧吴冠沿岸再泵入育苗场蓄水池,经沉降过滤、消毒,输送进需要进水的育苗池.盐度为28～30.113　实验设计

全程跟踪检测对虾育苗过程中的细菌数量和组成以及部分水质因子.育苗水体定期排放、添加,　　[收稿日期

]2006-10-25

[基金项目]福建省科技厅重点项目(2005N040)

[作者简介]苏国成(1962—),男,副教授,从事应用微生物研究.

290

集美大学学报(自然科学版)第12卷

换水量采用少量水交换技术.实验中,水体消毒采用泼洒质量浓度为5,7,9,25μg/mL的甲醛溶液;在育苗过程中,育苗池平均每2d至少用一次抗生素,药物包括:土霉素、新诺明、红霉素、青霉素、氟哌酸等,用药质量浓度为1～4μg/mL.设不添加消毒剂或抗生素的为对照组.

8

蛭弧菌(Bdellovibriosp.)微生态制剂为实验室自制,含菌量为110×10pfu/mL.在正常育苗过

程中,使用蛭弧菌微生态制剂.设不添加微生态制剂的为对照组.114　检测方法

1)细菌总数测定和弧菌数测定　细菌总数测定采用营养琼脂培养基,弧菌数测定采用TCBS培养基(平板稀释法),30℃培养24h后计数.

2)水样中细菌的分离和鉴定方法　以水样无菌海水多次稀释,采用涂布法分离微生物,经纯化后的菌株采用细菌常规鉴定方法进行鉴定

[2-3]

.

3)药敏实验　制备菌悬液,置于30℃摇床培养过夜.把菌液铺满对应编号的平板,夹取药敏纸片,分别贴于培养基上对应编号的位置.于30℃恒温倒置培养18h后测量抑菌圈大小.药敏纸片为中国药品制品鉴定所产品.

4)水质监测项目测定方法　盐度以比重计测定后再换算;pH值用色阶比色法测定,用pH计电位法校正.

2　结果

211　育苗期间海水中的细菌总数和组成的变化

不同月份育苗场蓄水池与育苗池水中细菌数变化如图1所示.由图1可见,2～3月份,海水中细菌总数一般较低,而4～6月份,海水中细菌总数增高,弧菌数的变化规律与细菌总数相似.海水中的细菌组成也随时间发生变化,2～3月份,水中细菌以假单胞菌(20%～25%)为主,其次为弧菌

(12%～

15%);4～6月份,海水中弧菌数量上升,一般可达25%以上,假单胞菌占18%～20%.育苗成活率较低的育苗池水体中弧菌比例甚至高达50%以上.随着育苗时间的延长,水体中细菌总数逐渐增多,与此同时,水体中pH值略为降低,这与育苗过程水体残余饵料、动物排泄物等有机质逐渐积累有关.212　甲醛处理对育苗池水体细菌总数的影响

用不同剂量甲醛消毒处理蓄水池和育苗池水体,其中蓄水池、15#池、16#池、17#池和对照池的甲醛处理量分别为25、9、7、5、0μg/mL.消毒后10h育苗池投放幼体,并分别于消毒后0、1、24h测定水体中细菌总数和组成的变化,实验结果如图2所示.高浓度甲醛处理1h后,蓄水池细菌总数下降明显,中浓度甲醛处理后育苗池水体中的细菌总数明显下降,但24h后各池细菌总数都迅速上升.

213　抗生素对育苗水体细菌总数的影响

育苗期间常规使用抗生素,所用药物见实验设计,一般是每日或隔日投放.1#池、2#池、3#池、

4#池和对照池水体细菌总数的变化情况如图3所示.实验表明,添加抗生素后在短时间内有一定的抑

制作用,但随着时间的延长并不能有效控制育苗水体细菌总数.分析认为,由于抗生素和消毒剂在使

　第4期苏国成,等:凡纳滨对虾育苗水环境的细菌学初探

291

用初期,水体中的细菌、藻类受抑制或死亡,大量死藻可作为细菌的营养物,所以细菌数量出现先下降后上升的现象.

214　育苗水体优势菌鉴定和耐药特征21411　菌株的分离纯化与鉴定

从外海水水样中分离出4个优势菌株,分别命名为A1,A2,A3,A4.从成活率较低的育苗池水体中分离出2个优势菌株,分别命名为B1,B2.30℃培养24h后各菌株的形态描述见表1.

表1　分离出的各菌株的形态特征

Tab11　Morphologicalcharacteristicsoftheisolatedstrains

菌株

A1A2A3A4B1B2

颜色浅黄色浅黄色透明　浅黄色浅黄色浅黄色

菌落形状表面情况光滑湿润光滑湿润光滑湿润光滑湿润光滑湿润光滑湿润

菌落直径/mm

　3　2～3

115～2115～2

圆形,中间隆起,边缘整齐扩散菌落,边缘不整齐圆形,中间隆起,边缘整齐圆形,边缘整齐扩散菌落,边缘不整齐圆形,边缘整齐

扩散至整个平板

　2～3

分离得到的6个菌株采用细菌常规鉴定方法进行鉴定,A1、A2、A3、A4、B2的鉴定结果为:葡萄糖发酵试验为阴性;动力试验为阳性;pH415生长试验为阳性;乙醇氧化试验为阴性;乙酸氧化试验为阴性;氧化酶试验为阳性;产3-酮基乳糖试验为阴性.5个菌株细菌常规鉴定结果可判定均属于假单胞菌属(Pseudomonas).B1的鉴定结果为弧菌属(Vibriosp).

21412　菌株的药物敏感性

用药敏纸片扩散法测定所分离的6个细菌菌株对24种抗菌药物的敏感度,结果见表2.从外海水水样中分离出的4个菌株,药敏谱基本一致,其中,A1和A2、A3和A4更为相似.对每一菌株都有效的药物有氟哌酸、复合磺胺、氯霉素和庆大霉素,其抑菌效果也比较好.从对虾育苗池水样中分离出两株菌具有较强的耐药性,B1仅对头孢三嗪、呋喃妥因、丁胺卡那霉素敏感,B2对24种抗生素均不敏感.

292

集美大学学报(自然科学版)表2　各菌株对药敏纸片的敏感性

Tab12　Thedrugsensitivityofthestrains

第12卷

mm

抗菌药物苯唑青霉素

氧哌嗪青霉素氨苄青霉素青霉素羧苄青霉素万古霉素四环素利福平氟哌酸妥布霉素链霉素复合磺胺抑菌圈直径

A1--------17-1615A2--------22141416A3--------17-1420A4--------17--16B1------------B2------------抗菌药物红霉素头孢三嗪氯霉素头孢他啶呋喃妥因头孢呋新丁胺卡那霉素头孢哌酮头孢噻肟庆大霉素头孢唑啉卡那霉素抑菌圈直径

A1-1523-16-15--15-13A2-2020---15--15--A314-20-15----16--A415-21----13-13--B1-16--15-14-----B2------------　　　注:抑菌圈直径<13mm者记为“-”.

215　蛭弧菌微生态制剂对细菌总数的影响

每天投放自制的蛭弧菌微生态制剂的实验池,蛭弧菌对控制细菌总数有较为明显的效果.从图4中可以发现,对照池和实验池到第6天时总菌数都有一定增加,一般来说,对虾育苗期间育苗池的水温基本保持在30℃以上,在幼体开口摄食以后投喂了大量的螺旋藻粉、微囊饵料和虾片等富含N、P的人工配合饵料,加上凡纳滨对虾蜕壳及排泄物的积累,使得育苗水体富含有机物.异养菌分解有机物获取营养而得到迅速生长繁殖.施加抗生素后,对照池的细菌数比较稳定,大致维持在815×10cfu/mL;而泼洒蛭弧菌液的实验池,其中的细菌总数则开始明显的下降,从第3天的516×104cfu/mL降到第15天的317×103cfu/mL.

4

3　讨论

311　对虾育苗期的优势菌群与疾病

在对虾育苗期间,细菌性疾病主要有两种:一是弧菌病,最主要的病原菌有鳗弧菌(V.

anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)和副溶血弧菌(V.parahaemolytics)等,以及假单胞菌(Pseudomonassp.)和气单胞菌(Aeromonassp.)等;二是丝状细菌病,最常见的病原菌是毛霉亮发

菌(Leucotnrixmucor)等.此外还有黄杆菌(Flavobacterium)、发光杆菌(Photobacterium)、亮发菌

(Leucothrix)等属中的一些种类.对虾幼体菌血症可由副溶血弧菌、假单胞菌、气单胞菌等多种细菌

混合感染发生[1,4].

本实验育苗前海水所分离优势菌的5个菌株都属于假单胞菌属.育苗成活率高的育苗池水体优势菌群多以假单胞菌为主,而成活率较低的育苗池水体的优势菌为假单胞菌和弧菌.比较育苗成活率高及育苗成活率较低的育苗池水体的细菌总数及优势菌群的种类,发现育苗水体假单胞菌为优势菌群有利于育苗成活.本实验表明,不同月份海水中细菌总数与细菌组成会发生一定的变化,蓄水池水中细菌组成的变化表明对虾幼苗存在感染弧菌病的可能性,必须采取一些行之有效的措施.

　第4期苏国成,等:凡纳滨对虾育苗水环境的细菌学初探

293

312　甲醛和抗生素处理育苗池水体对其细菌特征的影响

在水产种苗培育中,为抑制细菌和有害菌的大量繁殖,防止病害的发生,通常在水体中使用消毒剂或抗生素[1,5].本实验采用甲醛与抗生素处理蓄水池和育苗池水体,作用1h后水体中细菌总数减少,但24h后水体中细菌总数又升高.从本实验分离的6个细菌菌株对24种抗菌药物的敏感度实验结果分析,经甲醛与抗生素处理的育苗池水体中的优势菌对抗生素的耐药性明显提高,说明甲醛与抗生素的使用破坏育苗水体的正常菌群,具有抗药性的菌群暴发性生长,最终使育苗水体的细菌总数水平不能得到有效控制.这与乔振国等人用剂量有待进一步探讨.

313　微生态制剂对育苗水体的影响

水产微生态制剂目前有光合细菌、枯草杆菌、硝化细菌、蛭弧菌、乳酸菌等性菌,其中对溶藻弧菌和副溶血弧菌的裂解率高达98%以上

[5]

[7-8]

[6]

的研究结果一致.同时,结果表明,甲醛影响对虾幼体的

发育,使用5μg/mL甲醛8h内可使幼体推迟发育5h.因此,如何合理选择抑菌剂,确定合适的使

.其中,蛭弧菌

微生态制剂的作用是通过裂解宿主菌的方式增殖.研究表明,蛭弧菌可以选择性裂解大多数革兰氏阴

.本实验使用自制的蛭弧菌微生态制

剂的实验池对控制细菌总数有较为明显的效果,在成苗率上可以和以前常用的抗生素药物相媲美.今后,深入研究蛭弧菌微生态制剂的使用方法和使用效果,对于水产养殖与育苗有重要意义.

[参考文献]

[1]俞开康,战文斌,周丽,等.我国沿海养殖对虾的疾病及研究现状[J].中山大学学报:自然科学版,2000,39

(增刊):125.

[2]布坎南,吉本斯.伯杰细菌鉴定手册

[M].8版.北京:科学出版社,1984.

[3]郑福寿,陈绍铭.水生微生物学实验法[M].北京:海洋出版社,1990.

[4]林美兰,倪纯治,刘文华,等.厦门同安西柯对虾养殖池的细菌数量动态[J].台湾海峡,1998,17(2):1572161.[5]LUISFA,BORISB,L#CIDESA,etal.Necrotizinghepatopancreatitis(NHP)

infectedPenaeusvannameifemale

broodstock:Effectonreproductiveparameters,naupliiandlarvaequality[J].Aquaculture,2006,25(31):3372343.[6]乔振国,王建钢,于忠利,等.锯缘青蟹苗池微生态环境影响因素的初步探讨[J].海洋渔业,2006,28(1):42247.[7]杨先乐,曹海鹏,钱云云.噬菌蛭弧菌———水产动物病害生物防治的新工具[J].淡水渔业,2006,36(2):55260.[8]张新明.对虾养殖用微生态制剂菌株的筛选与应用效果的研究[D].青岛:中国海洋大学水产学院,2004.

StudyofBacteriaintheSeedlingPondsofLitopenaeusvannamei

SUGuo2cheng

1,2

,ZHOUChang2yi

1,2

(1.SchoolofBiotechnologyEngineering,JimeiUniversity,Xiamen361021,China;2.

KeyLaboratoryofScienceand

TechnologyforAquacultureandFoodSafety(JimeiUniversity),FujianProvince,Xiamen361021,China)

Abstract:Basedontheexaminationofbacteriaamount,compositionandsomewaterqualitiesintheseedlingpondsofLitopenaeusvannamei,theeffectsofformaldehyde,antibioticsandBdellovibriomicroecolog2icalpreparationwerestudied.

Theresultsshowedthatformaldehydeandantibioticscouldnotcontrolthetotal

Tokeepupadom2

countsofbacteriaeffectively,butcouldchangethedominantandcompositionofbacteria.inantpositionofBdellovibriocouldcontrolthetotalcountsofbacteria.

Keywords:Litopenaeusvannamei;seedling;bacterium;formaldehyde;antibiotics;Bdellovibrio

(责任编辑　马建华)